วัตถุประสงค์:เพื่อตรวจสอบว่าอะมิโนเปบทิเดสเอ็น (aminopeptidase N, APN) ทำหน้าที่เป็นตัวตอบ รับต่อสารพิษ Cry ในลูกน้ำยุงลายหรือไม่ วิธีการทดลอง:วิธีการ toxin-overlay ถูกเลือกที่จะนำมาใช้ ตอบคำถามข้างต้น อย่างไรก็ตามเทคนิค RNAi ซึ่งทางเราพัฒนาขึ้นสามารถตรวจสอบจุดประสงค์ ดังกล่าวในลูกน้ำยุงลายได้ง่าย เทคนิคดังกล่าวจึงถูกนำมาใช้ ผลการทดลอง:ลูกน้ำยุงลายที่ได้รับ RNA สายคู่ (dsRNA) ซึ่งจำเพาะต่อยีนเป้าหมายเข้าสู่ร่างกายทางปากโดยการแช่กับสารละลาย dsRNA พบว่ามีการยับยัง้การแสดงออกของยีนเป้าหมาย โดยลูกน้ำยุงลายอายุ 2 วันถูกแช่ในสารละลาย dsRNA ของยีนอะมิโนเปบทิเดส เอ็น (APN) ที่ความเข้มข้นต่างๆ (0.05 - 0.2 ?g/?l) ผลการทดลองพบว่า ที่ทุก ความเข้มข้นของ dsRNA มีการลดลงของการแสดงออกของยีน APN การยังยัง้การแสดงออกของยีนสูง ที่สุด (~100%) ที่การใช้ dsRNA ความเข้นข้นสูง (0.2 และ 0.1 ?g/?l) โดยที่ dsRNA ความเข้นข้นต่่ ที่สุดที่ใช้ (0.05 ?g/?l)พบการยับยัง้ประมาณ 57% การยับยัง้การแสดงออกของยีนเป็นแบบจำเพาะต่อ ลำดับเบส เนื่องจากการได้รับ dsRNA ของยีน โปรตีนเรืองแสง (green fluorescent protein) ไม่มีผลต่อ การลดลงของยีน APN นอกจากนั้นการยับยัง้ยังคงมีประสิทธิผลภายหลัง 36 ชัว่โมงนับจากการได้รับ dsRNA เรมิ่ ต้น อย่างไรก็ตาม ผลการทดสอบความเป็นพิษพบว่า APN อาจไม่ใช่ตัวตอบรับต่อสารพิษ Cry4 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง:การแช่ลูกน้ำยุงลายในสารละลาย dsRNA ซึ่งเป็นวิธีที่ง่ายและมี ประสิทธิภาพสามารถยับยัง้การแสดงออกของยีนเป้าหมายได้อย่างชัดเจนและมีความจำ เพาะเราประสบ ความสำเร็จในการยับยัง้การแสดงออกของยีน APN ในลูกน้ำได้ตัง้แต่ชัว่โมงที่12 โดยถึงแม้ว่าจะไม่ สามารถหาตัวตอบรับต่อสารพิษ Cry4B ข้อเสนอแนะสำหรับงานวิจัยในอนาคต: เนื่องจากมีการ พบว่าโปรตีนตัวตอบรับหลายชนิดสามารถจับกับสารพิษ Cry ได้ อย่างน้อยในสภาพแวดล้อมที่ทำเทียม ขึ้น (in vitro) เป็นไปได้ว่าสารพิษต้องการตัวตอบรับหลายชนิดสำหรับการทำงานอย่างมีประสิทธิภาพ ดังนั้นการค้นหาโปรตีนตัวตอบรับเพียงตัวเดียว จึงไม่มีผลใดๆ การยับยัง้การแสดงออกของยีนของ โปรตีนหลายชนิดดังกล่าวอาจจำเป็นสำหรับการลดความเป็นพิษของสารพิษ Cry Objectives: To determine if the putative Cry toxin receptor, aminopeptidase N (APN), is indeed function as the receptor in the Aedes aegypti larvae. Methods: We originally proposed to use the toxin-overlay method to answer the above question. However, we have developed the RNAi technique that can be easily performed in the A. aegypti larvae. Results: Ingestion (via soaking) of A. aegypti larvae with gene-specific dsRNA resulted in targeted suppression. The 2-day old larvae were soaked in aminopeptidase N (APN) dsRNA at various concentrations (0.05, 0.1 and 0.2 ?g/?l). It was found that at all concentration there were reduced APN transcripts. The highest suppression (~100%) was found at high concentration used (0.2 and 0.1 ?g/?l); at lower concentration (0.05 ?g/?l) it showed ~ 57% reduction. This knockdown effect is sequence-specific since ingestion of dsGFP (green fluorescent protein) did not reduce APN transcripts. Moreover, the silencing effect was still effective after 36 hours after the initial ingestion. However, toxicity test suggested that the APN isoform tested may not be the functional receptor to Cry4B toxin. Conclusion: A simple and effective method of soaking the mosquito larvae in the solution of dsRNA can strongly and specifically silenced the target gene. In so doing, we have successfully knocked down the larval APN gene as soon as 12 hours. Even though, the receptor to Cry4B toxin was not found; we have developed the method that can be employed in high-throughput reverse genetic screening in the mosquito larvae. Suggestions: Since multiple proteins (receptors) are found to be able to bind to Cry toxins, at least, in vitro, it is possible that for the toxin to be effective it needs to employ that many receptors. Therefore, simply targeting a single receptor may not have any effect – multiple knockdown of such proteins may be needed to reduce the toxicity of Cry toxin.