ปัจจุบันการตรวจวินิจฉัยเชื้อโรคเรื้อนด้วยการนับจำนวนเชื้อย้อมติดสีทนกรด และอ้างอิง ปริมาณเชื้อโดยใช้ค่า bacterial index เป็นเทคนิคที่นำมาใช้ร่วมกับการตรวจวินิจฉัยจากอาการทาง คลินิค เพื่อจำแนกประเภทผู้ป่วยโรคเรื้อนประเภทเชื้อมาก และประเภทเชื้อน้อย แสดงประสิทธิผล การรักษาด้วยยาเคมี และแสดงถึงการกลับเป็นโรคซ้ำ แต่เนื่องจากตรวจนับจำนวนเชื้อที่ติดสีย้อม ติดสีทนกรดภายใต้กล้องจุลทรรศน์มีข้อจำกัดทั้งทางด้านความจำเพาะ และความไวในการนำมาใช้ ตรวจวินิจฉัยโรคทางคลินิก ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนา และประเมินเทคนิค fluorescence real-time PCR เพื่องานตรวจวินิจฉัยเชื้อโรคเรื้อน และตรวจวิเคราะห์เชิงปริมาณ โดย การสกัด DNA จากตัวอย่างชิ้นเนื้อผิวหนังด้วยนำยาสำเร็จรูป Flexigene ทำปฏิกิริยาเพิ่มขยาย จำนวนชิ้นส่วน DNA เป้าหมายที่ตำแหน่ง 16S rRNA gene ขนาด 171 คู่เบสของเชื้อดโรคเรื้อนใน หลอดคาพิลารี (capillary) ปฏิกิริยาเกิดขึ้นด้วยเครื่องอัติโนมัติ LightCycler Real-time PCR และ ตรวจวัดสัญญาณการเรืองแสงของสาร SYBR Geen I ที่ติดฉลากบนผลิตผล PCR จากการศึกษา การตรวจวิเคราะห์เชื้อโรคเรื้อนเบื้องต้นพบว่า เทคนิคนี้มีความจำเพาะต่อการวิเคราะห์เชื้อโรคเรื้อน (Mycobacterium leprae) และมีความไวในตรวจหา DNA ของเชื้อต่ำสุด 20 เฟมโตกรัม หรือ ตรวจหาเซลล์ต่ำสุด 1 เซลล์ เมื่อศึกษาอุณหภูมิหลอมตัว (melting temperature) ของผลผลิต PCR ด้วยโปรแกรม melting analysis ของเครื่อง LightCycler Real-time PCR พบว่า ผลผลิต PCR ที่ ได้มีค่าอุณหภูมิหลอมตัวประมาณ 86 องศาเซลเซียส จากการตรวจนับจำนวน เชื้อโรคเรื้อนใน ตัวอย่างผิวหนังของผู้ป่วยประเภทเชื้อมาก 40 ราย ด้วยโปรแกรม quantitative analysis ของ เครื่องมือ มีจำนวนตั้งแต่ 1.07 x 102 – 1.08 x 108 เซลล์ ต่อ ชิ้นเนื้อผิวหนัง 6x6 มิลลิเมตร และ จำนวนเชื้อโรคเรื้อนในผิวหนังของผู้ป่วยประเภทเชื้อน้อย 28 ราย มีประมาณ 3.87 x 102 – 3.9 x 103 เซลล์ ผลการศึกษาในเบื้องต้นนี้แสดงให้เห็นว่า LightCycler real-time PCR เป็นเครื่องมือที่ สามารถนำมาใช้วิเคราะห์เชื้อโรคเรื้อนเชิงปริมาณ และเป็นเครื่องมือทางชีวโมเลกุลสำหรับวิเคราะห์ เชื้อโรคเรื้อนเชิงปริมาณในศึกษาอื่นครั้งต่อไป Leprosy is chronic infection disease caused by Mycobacterium leprae, an organism that cannot be cultivated on artificial medium. Enumeration of M. leprae for determination of bacterial index is required for leprosy classification, monitoring of leprosy chemotherapy and diagnosis of relapse. In clinical application, quantification of M. leprae relies on microscopic examination and counting of bacilli in stained specimens. The counting method yielding results with limited specificity and sensitivity. This study is aimed to develop and evaluate the application of a fluorescence real-time PCR assay for quantifying M. leprae in skin specimens. The real-time PCR is based on a capillary format of the LightCycler using SYBR Green I fluorescent dye as a detection signal. Primers were applied to amplify a portion of 171 bp fragment of M. leprae 16S rRNA gene. Using commercial Flexigene, with modifications, resulted in high yields of isolated DNA. The PCR assay was specific for M. leprae and able to detect as low as 20 fg of M. leprae DNA. The analytical sensitivity was as low as one cell of bacilli. The melting temperature of this PCR product was 86°C. By the use of normalized quantitative real-time PCR, M. leprae was detected in 40 multibacillary (MB) patients with bacilli number in the range of 1.07 x 102 – 1.08 x 108 bacilli in 6x6 mm skin biopsy specimen. The detectable number of bacilli in skin biopsies from 28 paucibacillary (PB) patients is of the order of 3.87 x 102 – 3.9 x 103 bacilli. The preliminary results demonstrated that LightCycler real-time PCR appeared to be a robust tool for quantitative detection of leprosy bacilli in clinical specimens and could be adopted as a molecular tool for quantification of M. leprae in other experimental settings.